Anti-Flag瓊脂糖凝膠Anti-Flag Affinity Gel可(ke)以實現高效快速的(de)抗原分離。免(mian)疫(yi)(yi)沉(chen)(chen)淀試劑盒配有經過(guo)優化預制的(de)緩沖液，為免(mian)疫(yi)(yi)沉(chen)(chen)淀實驗提供了(le)最佳的(de)反(fan)應(ying)條件，增強了(le)免(mian)疫(yi)(yi)沉(chen)(chen)淀實驗的(de)穩定性(xing)。本產品可(ke)廣泛(fan)應(ying)用于細(xi)胞裂解物、細(xi)胞分泌上清(qing)、血清(qing)、腹水(shui)等樣品中抗原的(de)免(mian)疫(yi)(yi)沉(chen)(chen)淀反(fan)應(ying)。

訂購信息

常溫運輸(shu)。4℃保存(cun)，有效(xiao)期24個月。

技術參數

貼壁細胞樣品

1.移去培養基，用PBS洗細胞(bao)兩(liang)次。

2.收集細胞(bao)至1.5 mLEP 管內，按比例(li)加(jia)入(ru)IP Lysis/Wash Buffer，同(tong)時加(jia)入(ru)PMSF等相(xiang)應的(de)抑(yi)制劑(ji)，混勻后置(zhi)于(yu)冰上(shang)靜置(zhi)5-20 min（期間混勻幾次）。

3.4 ℃, 12000-16000 g,10 min離心收集上(shang)清液，置(zhi)(zhi)于冰上(shang)以備后續實驗（或置(zhi)(zhi)于-80 ℃長期保存(cun)）。

培養皿(min)IP Lysis/Wash Buffer推(tui)薦使(shi)用體積：

懸浮細胞樣品

1.4℃、500-1000 g、10 min，收集(ji)細(xi)胞，棄(qi)上清。

2.用(yong)PBS 洗細胞(bao)一次，即(ji)用(yong)PBS 將細胞(bao)團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收(shou)集細胞(bao)，棄上清。

3.用預冷的(de)IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。每50 mg 細胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同(tong)時加(jia)入PMSF等相應(ying)的(de)抑制(zhi)劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min（期間(jian)混勻幾次）。

4.4 ℃, 12000 -16000 g,10 min離心收集(ji)上清液，置于冰(bing)上以備后續實驗（或置于-80 ℃長期(qi)保(bao)存）。

血清樣品

　一般建議(yi)(yi)建議(yi)(yi)用IP Lysis/Wash Buffer稀釋(shi)血清樣品至(zhi)目標蛋白終(zhong)濃度為50~150 µg/mL，置(zhi)于冰上備用（或置(zhi)于-20 ℃長期(qi)保存）。

免疫沉淀

【注(zhu)】：為保證凝(ning)膠均勻分布，使用前通過反(fan)復顛倒或輕(qing)微渦旋混勻瓶(ping)中凝(ning)膠。

1.將25 µL的Anti-Flag Affinity Gel加入1.5 mL 離(li)心管中(zhong)。

2.向凝膠中加入500 µL 預冷PBS，輕(qing)柔混勻。

3.將離(li)心管放入(ru)離(li)心機中1000rpm，5min收集凝膠到離(li)心管的底部，去除上清。

4.向離(li)心管中(zhong)(zhong)加入(ru)200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離(li)心管數次或輕微渦旋(xuan)混勻1 min。將離(li)心管放入(ru)離(li)心機中(zhong)(zhong)1000rpm，5min收(shou)集凝(ning)膠到離(li)心管的底部，去除(chu)上清。

5.將制備(bei)好含(han)有(you)Flag標記(ji)蛋白的樣品加入裝(zhuang)有(you)凝(ning)膠的離心管(guan)中，保持混勻室溫下孵育(yu)2-4 h。

6.離心1000rpm，5min收集凝膠，除(chu)去未結合(he)的樣品，保存以備分析。

7.向離心管中加(jia)入500 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻。收集(ji)凝膠(jiao)，棄上清。再重復(fu)洗兩次。

8.變性洗脫(tuo)：向離(li)心(xin)管(guan)中加(jia)入(ru)80-100 µL SDS-PAGE Sample Loading Buffer（1×），將樣品置于100℃水浴或者金(jin)屬浴中加(jia)熱10 min。通過磁(ci)力架分(fen)離(li)磁(ci)珠，保留含有目的抗原的上清。

【注(zhu)】：如需保持蛋白活(huo)性，也(ye)可采用(yong)以下洗脫方(fang)式。

低pH洗脫：向離心(xin)管(guan)中(zhong)加入(ru)100 µL Elution Buffer。保(bao)持混勻在室(shi)溫下孵育離心(xin)管(guan)5-10 min。通(tong)過離心(xin)分離凝(ning)膠，保(bao)留含(han)有目的(de)抗原的(de)上清。每100 µL洗出液中(zhong)加入(ru)20 µL Neutralization Buffer來中(zhong)和低pH。

注意事項

1.本產品僅(jin)限于科學(xue)實(shi)驗研究使用(yong)，不(bu)得(de)用(yong)于臨床(chuang)診斷(duan)、治療等領域。

2.請勿高(gao)速(su)離心、干(gan)燥或冷(leng)凍凝(ning)膠，這些(xie)操(cao)作會(hui)導致凝(ning)膠聚集而降低(di)結合能力。

3.IP實驗(yan)(yan)(yan)中不同類型的(de)抗(kang)體(ti)與(yu)抗(kang)原結合的(de)親和性是(shi)有區別(bie)的(de)，抗(kang)體(ti)與(yu)抗(kang)原結合還會受到(dao)IP Lysis/Wash Buffer的(de)影響，因(yin)此，如使用(yong)本實驗(yan)(yan)(yan)步驟不能獲得最佳(jia)的(de)實驗(yan)(yan)(yan)結果，可(ke)自行優化操作(zuo)細節或者篩選及配制(zhi)緩(huan)沖液進(jin)行實驗(yan)(yan)(yan)，推(tui)薦使用(yong)李(li)記生物的(de)相(xiang)關(guan)產品，參照相(xiang)關(guan)產品推(tui)薦。

4.微(wei)(wei)球使用前應充(chong)分振蕩均勻。微(wei)(wei)球應保存在儲存溶(rong)液中，防止干燥(zao)。

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