產品描述
　　Quick Cell PCR法支原體檢測試劑(ji)盒，本試劑盒采用(yong)一對(dui)支(zhi)原(yuan)體特異性引物(wu)，用(yong)于對(dui)樣品的支(zhi)原(yuan)體基因組DNA進(jin)行(xing)PCR擴增(zeng)，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對(dui)PCR產物(wu)進(jin)行(xing)檢(jian)測。試(shi)劑(ji)盒內(nei)同時含有內(nei)參(can)對(dui)照，用(yong)于監控PCR是否(fou)正常擴增(zeng)。

　　本試(shi)劑盒(he)與(yu)MB Zell Shield 13-0050等產品相比更具(ju)優勢(shi)，替代性強，具(ju)體情況可(ke)詳見下(xia)文或咨詢銷售人員。
　　本試劑盒(he)是(shi)一種(zhong)廣譜的支原體檢測試劑盒(he)，可(ke)以識(shi)別所有(you)100多(duo)種(zhong)至今已發現的支(zhi)原(yuan)體(ti)；能(neng)用于檢測一切可(ke)能(neng)含支(zhi)原(yuan)體(ti)的樣品(pin)，比如：體(ti)外細胞培養(yang)的上清；血清；各種(zhong)體(ti)液，如唾液、尿液、鼻腔分(fen)泌(mi)物等(deng)；其他液體(ti)樣品(pin)等(deng)。具有100%支(zhi)原(yuan)體(ti)識別(bie)率、靈敏度*、含內參(can)條帶(dai)從而可(ke)以區分(fen)真(zhen)陰(yin)性樣品(pin)和假陰(yin)性樣品(pin)、無(wu)需配套(tao)相對昂貴(gui)的熒光(guang)定量PCR儀等(deng)優點(dian)。
　　經多次(ci)測試(shi)，本試(shi)劑盒(he)有(you)記錄可以識別在體(ti)外細(xi)胞培(pei)養中曾經報(bao)道(dao)出(chu)現的(de)(de)20種支原(yuan)體(ti)，根據文獻報(bao)道(dao)，這(zhe)些(xie)支原(yuan)體(ti)基本能占污染細(xi)胞的(de)(de)支原(yuan)體(ti)種類的(de)(de)100%。具體(ti)如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的(de)(de)縮寫(xie); A.為Acholeplasma的(de)(de)縮寫(xie)）。

訂購信息

【注】：
以下(xia)試劑需(xu)要(yao)自行準備：①普通的Taq DNA 聚合酶(mei)（推薦(jian)使用 Takara 品牌的(de)Ex Taq Hot Start version，貨號：RR006A，已(yi)包含2.5 mM 的(de) dNTP）和相應的(de)緩沖(chong)液；② 2.5 mM的(de)dNTP；③DNA上樣緩沖(chong)液（推(tui)薦使用(yong)李記生物的GelRed預染DNA上樣緩(huan)沖(chong)液(5X)，貨號：AN34L047，該緩(huan)沖液(ye)已含無(wu)毒核酸染料(liao)，不需要接觸(chu) EB 等致癌物質）。
運輸(shu)與保存(cun)條件
　　冰袋運輸，-20℃保(bao)存，可(ke)以保(bao)存五年。
使(shi)用方法
1.待測(ce)樣品的(de)準備
取換液后培養2-3 d且匯(hui)合度在90%左右的細胞培養液上(shang)清（貼(tie)壁細胞）。懸浮(fu)培養的細胞在換液傳代后，生長2-3 d再取(qu)培養液(ye)進(jin)行檢測。可以按照以下兩(liang)種方法之一(yi)進(jin)行樣品的前處理：
方法一
（1）取(qu) 150μL上(shang)述待測樣(yang)品到1.5 mL離(li)心管內，在(zai)普通臺式(shi)離(li)心機上(shang)1000 rpm 低速離(li)心5 min；
（2）上(shang)述離心上(shang)清(qing)液，95 ℃加熱(re)處理5 min（可以轉移到 PCR 管內，在 PCR 儀上(shang)進行加熱(re)處理），簡單離心（1000g，5 s）后，取上(shang)清(qing)進行檢測(ce)。
方(fang)(fang)法二(er)（推(tui)薦本方(fang)(fang)法，有(you)高速離心機的(de)(de)的(de)(de)可(ke)選(xuan)用(yong)本方(fang)(fang)法，可(ke)以(yi)去PCR抑制物，準確性更高。）
（1）根據濃縮倍數(shu)，可以取100 - 1500μL上述待測樣品到(dao)1.5 mL離(li)(li)(li)心管內，普通(tong)臺式離(li)(li)(li)心機(ji)1000 rpm 離(li)(li)(li)心5 min，將離(li)(li)(li)心后的(de)上清轉(zhuan)移(yi)到另一個離(li)(li)(li)心管內，丟棄(qi)細胞沉淀。
（2）將(jiang)上(shang)清繼(ji)續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清，用(yong)50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推薦使(shi)用(yong)，樣(yang)品可(ke)以長期保存）或(huo)者去離子水(shui)（樣(yang)品比(bi)較不穩定，只適合當天(tian)或(huo)短期內檢測使(shi)用(yong)）重懸、沉淀(dian)（沉淀(dian)中含有支原體），吹(chui)吸均勻。
（3）該(gai)重懸后(hou)(hou)的樣品可以(yi)直接(jie)檢(jian)測(ce)，也可以(yi)進(jin)行熱處(chu)(chu)(chu)(chu)理后(hou)(hou)再檢(jian)測(ce)（熱處(chu)(chu)(chu)(chu)理后(hou)(hou)，樣品保存更穩定(ding)）。熱處(chu)(chu)(chu)(chu)理具體(ti)如下：95 ℃加(jia)(jia)熱處(chu)(chu)(chu)(chu)理 5 min（可以(yi)轉移到PCR管內，在PCR儀上進(jin)行加(jia)(jia)熱處(chu)(chu)(chu)(chu)理），簡單離心(xin)（1000g，5 s）后(hou)(hou)，取上清進(jin)行檢(jian)測(ce)。
【注(zhu)】：
① 這(zhe)里的細胞(bao)培養上(shang)清不是指(zhi)細胞(bao)經*酶(mei)消(xiao)化后的離心上(shang)清，而是指(zhi)至少培養 2 d后的貼壁細胞培養液上清或懸浮(fu)細胞培養液；
② 本步驟的(de)低速離(li)心(xin)(xin)是為了去除(chu)哺乳動(dong)物細胞(bao)，以排除(chu)其不(bu)必要(yao)(yao)的(de)干擾。所以離(li)心(xin)(xin)力要(yao)(yao)嚴(yan)格控制在150-200 g，該離(li)心(xin)(xin)力下，哺乳動(dong)物細胞(bao)將被沉淀下來(lai)而(er)支原體不(bu)會；
③ 收(shou)集的(de)待(dai)測(ce)細胞培養液樣品如果不(bu)立(li)即檢測(ce)，請放于-20℃或-80℃冰箱保(bao)存；
④ 如果預期(qi)待測(ce)樣品(pin)支原體(ti)含量較(jiao)少（比如低溫保存的(de)血清(qing)、臍(qi)帶血、*mei、抗生(sheng)素(su)、未使(shi)用(yong)的(de)培(pei)養液、生(sheng)物制品(pin)、極個別細胞培(pei)養上清(qing)等），可以(yi)采取(qu)措施以(yi)提高(gao)檢測(ce)的(de)靈敏度，具體(ti)方法(fa)請(qing)看后文(wen)注(zhu)意事項部分：如何提高(gao)本(ben)試(shi)劑盒檢測(ce)靈敏度。
2.PCR 體系的配(pei)制  
（1）按照(zhao)25μL體系配制比例(li)如下。如果是(shi)多樣品檢測，加兩個對照(zhao)樣品后各組分(fen)總體積如下表。配制好的混合液，按每(mei)管(guan)23μL分(fen)裝到0.2 mL的PCR管中。

【注(zhu)】：
① 總體積中(zhong)(zhong)多配制 6% 是為了防(fang)止(zhi)移液(ye)導致誤差，以保證(zheng)每(mei)個反(fan)應管中(zhong)(zhong)的反(fan)應液(ye)足量；
② 如果有條件，PCR 體系(xi)的(de)配制建議在冰上進行操作(zuo)；
③ 本(ben)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)不推薦使用 2× 的 PCR mixture（內含 Taq 酶(mei)、緩沖液和 dNTP），建議使用Taq酶(mei)、10×Taq 緩沖液和 dNTP 等試(shi)(shi)劑(ji)配制PCR體系；
④ 為了避免可能的污染，收到的支原體引(yin)物和(he)內參，可以適當分裝（比如：每(mei)支 40μL）后冷凍保存；
⑤ 如(ru)果使用(yong)的是其他 Taq 酶（前提是：陰性對照的 586 bp 內參條帶(dai)必須(xu)有一(yi)定亮度，且穩定性良(liang)好，否則不能使用(yong)），酶、去(qu)離(li)子(zi)水的加入(ru)量需要根據其說明書進行調整。
（2）加入(ru)待(dai)測樣品、陰性(xing)和陽性(xing)對照樣品。樣品檢(jian)測管(guan)中加入(ru)2μL待(dai)測樣品，陰性(xing)對照管(guan)加入(ru)2μL去(qu)離子水，陽性(xing)對照管(guan)加入(ru)2μL陽性(xing)支(zhi)原體 DNA。
【注】：
① 裝有陽(yang)性支原(yuan)體 DNA 的螺口管(guan)開蓋之前，低速離心或用手指捏住(zhu)，用力甩一下即可(ke)；
② 進行(xing)反應(ying)體系(xi)配制的房間，與樣(yang)品(pin)(pin)前處理(li)、加陽性對(dui)照DNA、樣(yang)品(pin)(pin)DNA的房間建(jian)議分開。
3.PCR 參數設置

4.PCR 產物的瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電(dian)泳
　　配制含(han)溴化乙(yi)錠（EB）的(de)(de)濃度為 1.5%的(de)(de) DNA 瓊脂糖凝膠（推薦(jian)使用李記生(sheng)物(wu)的GelRed預染(ran)DNA上樣緩(huan)沖液(5X)，貨號：AN34L047，該(gai)產品預添加(jia)了(le)無毒安(an)全染料）；當溴(xiu)酚藍染(ran)料跑(pao)出上(shang)樣(yang)孔(kong) 3-4 cm時，停止電泳，拍照(zhao)。
5.結果(guo)判斷  
PCR 擴增的結(jie)果有可能出現(xian)以(yi)下幾種情(qing)況：

　　支(zhi)原體 PCR 擴增結果：586 bp 條帶(dai)為(wei)內(nei)參(can)條帶(dai)，270 bp 左右(you)(you)的(de)條帶(dai)為(wei)支(zhi)原體特(te)異(yi)(yi)條帶(dai)（各支(zhi)原體的(de)條帶(dai)大(da)小會(hui)略有(you)不(bu)同，總體在(zai) 266-280 bp 之間。注意(yi)：支(zhi)原體特(te)異(yi)(yi)條帶(dai)的(de)大(da)小不(bu)會(hui)超過該范圍(wei)。超過該范圍(wei)的(de)，就是雜帶(dai)！）。隨著(zhu)支(zhi)原體 DNA 模板的(de)增加，270 bp 左右(you)(you)的(de)條帶(dai)會(hui)逐漸(jian)(jian)增強而 586 bp 的(de)內(nei)參(can)條帶(dai)會(hui)逐漸(jian)(jian)減(jian)弱，甚至消失。
　　泳道1：陰性對照或者(zhe)沒有支(zhi)原體污(wu)染的樣品(pin)；
　　泳道2：極重度支原體污(wu)染樣品(pin)；
　　泳道3：重(zhong)度污染樣品；
　　泳道4：中度污染樣品；
　　泳道5：輕度污染樣品；
　　泳道6：PCR 的擴(kuo)(kuo)增(zeng)被細胞(bao)的代謝(xie)產物抑(yi)制，導致擴(kuo)(kuo)增(zeng)失敗。
　　M：DNA marker.
注(zhu)意(yi)事項
1.設有(you)陰(yin)性對(dui)照，保證本試劑(ji)盒含有(you)的支原體引物(wu)和(he)內(nei)參(can)以(yi)及整(zheng)個反應體系正常。
2.只有(you)當陰性(xing)對(dui)照(zhao)的結果(guo)沒有(you)出(chu)現(xian) 270 bp 左(zuo)右(you)的支原體特異條帶時(shi)，其他樣(yang)品的檢測結果(guo)才是可(ke)信(xin)的。
3.每次(ci)試(shi)驗(yan)(yan)陰性(xing)對(dui)照(zhao)中 586 bp 的(de)(de)(de)(de)內參條帶都(dou)必須(xu)出現而且(qie)要有(you)(you)一定的(de)(de)(de)(de)亮度(du)，才說明試(shi)驗(yan)(yan)成功。如果(guo)陰性(xing)對(dui)照(zhao)的(de)(de)(de)(de)內參條帶經(jing)常沒有(you)(you)出現或(huo)(huo)者非常弱，說明試(shi)驗(yan)(yan)不成功，這(zhe)時可以(yi)采取(qu)以(yi)下幾(ji)個(ge)措(cuo)(cuo)施： a.請使用普通蒸餾水(shui)或(huo)(huo)去離(li)子(zi)水(shui)。不能使用去內毒(du)素的(de)(de)(de)(de)水(shui)、DEPC 處理(li)的(de)(de)(de)(de)水(shui)或(huo)(huo)者商品(pin)化(hua)的(de)(de)(de)(de) DNase/RNase-free的(de)(de)(de)(de)水(shui)，這(zhe)幾(ji)種(zhong)水(shui)都(dou)可能會抑制 PCR 擴(kuo)增的(de)(de)(de)(de)效率。 b.請使用 Takara 公司的(de)(de)(de)(de) Ex Taq Hot Start version（推薦(jian)。貨號： RR006A，可用 400 次(ci)）。 c.可以(yi)嘗試(shi)增加 PCR 的(de)(de)(de)(de)循環數，比如：由原來的(de)(de)(de)(de) 40 個(ge)循環，增加到(dao) 45 個(ge)循環。如果(guo)采取(qu)以(yi)上幾(ji)個(ge)措(cuo)(cuo)施后，陰性(xing)對(dui)照(zhao)的(de)(de)(de)(de)內參條帶仍然經(jing)常沒有(you)(you)出現或(huo)(huo)者非常弱，請聯系廠家解(jie)決。
4.如果(guo)直接使(shi)用細胞(bao)培養(yang)液上清進行檢(jian)測(ce)，而檢(jian)測(ce)結果(guo)顯示該(gai)樣品(pin) 586 bp 條(tiao)(tiao)帶和 270 bp 左右的條(tiao)(tiao)帶都沒有出現（如圖 1，泳道 6）或者內(nei)參(can)條(tiao)(tiao)帶非常微(wei)弱，在排除 PCR試劑的問(wen)題后(hou),說明該(gai)樣品(pin)含有抑制 PCR 擴增的代謝產物。
5.防(fang) DNA 污(wu)染注意事項： a.強烈建議所有操作全(quan)部使(shi)用進(jin)口濾芯(xin)吸頭（比如(ru)：Axygen 濾芯(xin)吸頭）進(jin)行操作，以免(mian)試劑(ji)被污(wu)染。 b.“PCR 體(ti)(ti)系配制的(de)(de)房(fang)間(jian)、移(yi)液槍(qiang)"（不要(yao)使(shi)用細(xi)胞(bao)培(pei)養室的(de)(de)移(yi)液槍(qiang)！）和(he)“PCR 產物(wu)的(de)(de)電泳房(fang)間(jian)、移(yi)液槍(qiang)"一(yi)定要(yao)分(fen)開(kai)，不能在同一(yi)個房(fang)間(jian)進(jin)行，也不能使(shi)用相同的(de)(de)移(yi)液槍(qiang)進(jin)行操作。 c.PCR 產物(wu)是導致假陽性的(de)(de)主(zhu)要(yao)原因，PCR 產物(wu)不要(yao)在 PCR 體(ti)(ti)系配制的(de)(de)房(fang)間(jian)中打開(kai)。 d.樣品處理的(de)(de)房(fang)間(jian)和(he)移(yi)液槍(qiang)，如(ru)有條件，建議也分(fen)開(kai)。 e.收(shou)到的(de)(de)支原體(ti)(ti)引物(wu)和(he)內(nei)參，可以分(fen)裝（比如(ru) 40 μL一(yi)支）后(hou)保存(cun)。
6.如發現細胞被支原體污染，推薦使用(yong)李記生物的Quick Cell支原(yuan)體(ti)祛除(chu)預防試劑盒，貨(huo)號：AC16L066；以及EZ 水(shui)浴鍋抑菌劑(ji)，貨號：AC16L162 和 EZ 細胞房除菌劑，貨(huo)號：AC16L143。產品詳情可咨詢銷售人員或(huo)見李記生物網站。
7.支原(yuan)(yuan)體(ti)檢測樣品可以分成兩類：①用(yong)含血清的培(pei)養(yang)液(ye)培(pei)養(yang)的哺乳(ru)動物細(xi)胞上清液(ye)，由于該條件非(fei)常適(shi)合(he)支原(yuan)(yuan)體(ti)生長，培(pei)養(yang)數天后，支原(yuan)(yuan)體(ti)密度一般較高(gao)，可達 10^7-9/mL，可以(yi)直接檢(jian)(jian)測。②低(di)溫保存的(de)血(xue)漿、血(xue)清、臍帶(dai)血(xue)、*酶、抗生素、未使(shi)用(yong)的(de)培養(yang)液等樣(yang)品，由于這些(xie)樣(yang)品即使(shi)有支(zhi)原(yuan)體(ti)污(wu)染，支(zhi)原(yuan)體(ti)含(han)量一般很少(shao)，直接使(shi)用(yong)快速支(zhi)原(yuan)體(ti)檢(jian)(jian)測試(shi)劑(ji)盒進(jin)行檢(jian)(jian)測，往(wang)(wang)往(wang)(wang)檢(jian)(jian)測不出來。這些(xie)樣(yang)品建議：（1）對(dui)樣品的支原體進(jin)行離心(xin)濃縮處理；（2）使(shi)用支(zhi)原體液體培(pei)養(yang)基(ji)（必須同時接(jie)種不含(han)jing氨(an)酸(suan)和含(han)jing氨(an)酸(suan)的兩(liang)種支(zhi)原體液體培(pei)養(yang)基(ji)）培(pei)養(yang) 3-7 d后，再(zai)進行檢測。具體方法(fa)請(qing)參(can)考(kao)李記生物(wu) Quick Cell 發光法(fa)支原(yuan)體(ti)檢測試劑盒，貨號：AC16L062 說明書中后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要 3-7 d，但是可靠性高(gao)。
8.該產品(pin)主(zhu)要用于細(xi)胞上(shang)清支原體污染(ran)檢(jian)測，僅限于科學實(shi)驗研究使用(yong)，不得用(yong)于臨床診斷、治療等領域。
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